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　　bob官方网站1.注射器进样装置 缺点是不能承 受高压，在压力超过150×105Pa后， 由于密封垫的泄漏，带压进样实际成 为不可能。

　　2.高压定量进样阀 这是通过进样 阀（通用六通阀）直接向压力系统 内进样而不必停止流动相流动的一 种进样装置。

　　*HPLC常用的标准柱是内径为4.6或3.9mm，长 度 为 15—30cm 的 直 行 不 锈 钢 柱 。 填 料 颗 粒 度 5— 10μm，柱效以理论塔板数计大约5000—20000。 *HPLC发展的一个重要趋势是减小填料颗粒度 （3—5um）和柱径（1mm）以提高柱效。 *液相色谱柱装柱方法有干法和湿法两种。

　　以得到压力为250×105 Pa的输出液体。 优点：能供给无脉冲的、稳定流量的输出。 缺点：液缸体积大，更换流动相不方便，不适用于频 繁更换流动相的实验，也不便于梯度洗提。

　　所谓梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多） 不同极性的溶剂，在分离过程中，按一定的程序连续 改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液极性的变化 来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。

　　Hd=CdDm/u 式中Cd为一个常数，由于分子在液体中的扩散系 数比在气体中小4～5个数量级，因此在HPLC中， 当流动相的线cm/sec时，可以忽略。

　　HPLC中传质阻力项可分为: （1）固定相传质阻力项 （2）流动相传质阻力项。 1）固定相传质阻力项 发生在液-液色谱分析中，试样分子从流动相到 固定相内进行质量交换的传质过程取决于固定液的 液膜厚度df和在固定液内的扩散系数Ds： Hs=（CSdf2/Ds）×u 式中Cs是与容量因子有关的系数。

　　He=2λdp 其含义和气相色谱相同。 二、纵向扩散相Hd（分子扩散项） 试样分子在色谱柱内随流动相向前时，分子本 身运动引起的纵向扩散同样引起色谱峰的扩展。

　　有紫外吸收的有机 灵敏度高；对流速、温 物（绝大多数） 度不敏感；可用于梯度 洗提 能产生荧光的具有 灵敏度高 对称共轭结构的有 机芳环分子

　　灵敏度低、对温度 敏感，不能用于梯 度洗脱 对温度敏感，洗脱 液背景电导的干扰 需消除

　　ⅱ滞留的流动相中的传质阻力项Hsm *流动相中的试样分子要与固定相进行质量交换， 需自流动相扩散到微孔内滞留区。 *如果固定相的微孔既小又深，则传质速率慢， 对峰的扩展影响大，该影响在整个传质过程中起到主 要作用。 *固定相的粒度越小,孔径越大,传质途径就越小, 传质速率也就越高,因而柱效就越高.滞留区传质和固 定相结构有关。 滞留区传质阻力项Hsm为:

　　通用型检测器（每种物质具 有不同的折光指数）。 灵敏度低、对温度敏感，不 能用于梯度洗脱。 偏转式、反射式和干涉型三 种。

　　d.电导检测器 电导检测器属电化 学检测器，是离子色谱 法中使用最广泛的检测 器。

　　e.蒸发光散射检测器 通用型检测器。 流出的分离物与高流 速的氮气混合，形成微小 均匀的雾状液滴。在加热 的蒸发漂移流动相不断被 蒸发，溶质分子被氮气带 入散射室，溶质颗粒受到 激光光源的激光束照射， 其散射光由光电二极管检 测产生电信号。

　　类型： *液-液色谱；*液-固色谱； *离子交换色谱；*离子对色谱； *离子色谱；*空间排阻色谱法等。

　　固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂。 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性。 流动相中的溶质分子（ X ）与溶剂分子（ S）在固定 相吸附剂上的竞争吸附：

　　*与GC的速率方程式在形式上是一样的。 *区别：纵向扩散项（B/u）可以忽略不计。影响 柱效的主要是传质阻力项。 *毛细管色谱的速率方程哪项可以不计,为什么?

　　构的有机芳环分子产生荧光。 如对多环芳烃，维生素B、黄 曲霉素、卟啉类化合物、农 药、药物、氨基酸、甾类化 合物等有响应。 （动画）

　　除紫外检测器之外应用最多的检测器。 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差 值。差值与浓度成正比。

　　GC与HPLC流动相差别 GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作力， 只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力， 能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。 且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和 pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种 或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 GC与HPLC操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）

　　HPLC的基本概念和理论基础与GC相同(如保留 值、分配系数、分配比、分离度、塔板理论、速率 理论等); 不同：流动相。液体扩散系数只有气体的万分 之一到十万分之一、粘度比气体大100倍，密度为 气体的1000倍左右（见表3-1）。

　　电信号的大小与单位时间进入散射室的溶质 颗粒的大小与数量成线性关系。 该检测器的相应值与式样质量成正比，即对 几乎所有样品的接近一致。

　　优点：灵敏度高，响应信号不受溶剂和温度的影响， 可用于梯度洗提。 缺点：不宜采用非挥发性缓冲溶液为流动相。

　　类型 紫外检测 器 荧光检测 器 检测对象 优点 缺点 不适用于对紫外光 完全不吸收的试样 线性范围小

　　高压泵按其性质可分为恒流泵和恒压泵。常用的两 种： a.往复式柱塞泵—恒流泵 柱塞每分钟大约需往复运动100次。

　　流速是调整分离 度和出峰时间的重要 可选择参数。 3.固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱， 其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分 离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自 行制备。

　　较大，为了能迅速地通过色谱柱，需对液体加压 力，压力很高，一般可达150～350×105Pa，高压 是HPLC的一个突出特点。

　　HPLC液相色谱法所需的分析时间较之经典液 体色谱法少得多，一般都小于1小时.

　　如：对氨基酸分析，用经典液相色谱法，一般需要 20多个小时，而HPLC法只需1小时。

　　GC:柱效约为2000塔板/米；HPLC柱效约为3万塔板/ 米以上。这是由于近年来研究出了许多新型固定相的结 果（如化学键合固定相），使分离效率大大提高。

　　度，如UV检测器，（10-9g）；荧光检测器（10-11g）。 由于HPLC的高灵敏度，分析所需试样很少（µL级）。

　　优 点 ： 死 体 积 小 （0.1mL），更换溶剂 方便，很适用于梯度洗 提。 缺点：输出有脉冲波动， 干扰某些检测器工作， 产生基线噪声，影响检 测灵敏度。

　　b.气动放大泵-恒压泵 根据液体压力传导原理： P1SA=P2SB 设计。 （动画）

　　*GC是一个抛线，有H最小； *LC的是一条斜率不大的直线，因为分子扩散相对H 值实际上已不起作用所致。

　　• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则在高效液相 色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略不计， 即：

　　（2）流动相传质阻力项 试样分子在流动相的传质过程中有两种形式： a在流动的流动相中； b在滞留的流动相中。 ⅰ流动的流动相中传质阻力项Hm 在流动相流过色谱柱内的填充物时, 流动相的流速 并不是均匀的，靠近固定相表面的试样分子走的距离 比中间要短一些.这种引起塔板高度变化的影响是与u 和dp的平方成正比，与试样分子在流动相中的扩散系数 Dm成反比：

　　应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高,10-9g/mL； 线形范围宽；

　　对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。

　　光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测 特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。

　　HPLC 是 指 流 动 相 为液相的色谱技术。 HPLC是20世纪70年 代发展起来的一项 高效，快速分析技 术。

　　• 液体的黏度比气体大 100倍，密度为气体的1000 倍，故降低传质阻力是提高 柱效主要途径。

　　• 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 • 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。分离 过程需要保持恒温。 • 改变淋洗液组成、极性是改 善分离的最直接的因素。

　　Xm nSa = Xa nSm 下标 m 、 a 分别表示流动相和固定相， n 是被吸附的溶剂分 子数。达到吸附平衡时，吸附平衡常数（K）可表示为：

　　K大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值就大。 凡能用薄层色谱法成功地进行分离的化合物，亦可用 液—固色谱法进行分离。 缺点:非线性等温吸附常引起峰的拖尾。

　　高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测（占 有机物的20%） HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机 介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对 分子量大、高沸点、热稳定性差的生化样品及高分子 和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80%。

　　二、液-液分配色谱法及化学键合色谱 *流动相和固定相都是液体； *两者互不相溶，有一个明显的分界面。 *试样在两相中分配，当达到平衡时：

　　流动相：亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流 动相的极性小于固定液的极性(正相 normal phase)， 反之流动相的极性大于固定液的极性(反相 reverse phase)。正相与反相的出峰顺序相反。 固定相：早期涂渍固定液，现已不采用。 化学键合固定相：将基团通过化学反应键合到硅胶 （担体）表面的游离羟基上，如C18柱（反相柱）。 自20世纪70年代末以来，LC分析70%～80%基本上在 化学键合相上进行.